细胞爬片就是让玻片浸在细胞培养基内,细胞在玻片上生长。主要用于组织学,免疫组织化学,冰冻切片,细胞涂片,原位杂交等。
细胞爬片的准备
1盖玻片的选择:
爬片可用一般的盖玻片,也可用专用细胞爬片(价格比较昂贵)但是细胞贴壁牢固,拍出照片效果好;
2爬片的剪裁:
可根据自己的需要,到染色时再将之切开,这样既保证了细胞均一性,又可同时做几个指标的染色剪裁成合适大小,置于6孔板、12孔板或24孔板;
3爬片的使用前处理:
将剪裁好的爬片,置于浓硫酸中浸泡并过夜,第二天先用自来水冲洗20遍,再置于无水酒清中浸泡6小时,再用三蒸水冲洗3遍(个人认为主要目的是将酸冲洗干净就可以了,如果不干净的话,细胞帖壁不好),放在饭盒或者玻璃培养皿中烘干后进行高压消毒。高压后取出放入烤箱中烤干,备用。烤干后可放入超净台中。
4多聚赖氨酸的使用:
很多人都将玻片用此处理,以使细胞与玻片结合更牢。但我在做爬片时从来没用过多聚赖氨酸,细胞贴壁仍然很好,且在做后续的免疫细胞化学染色、TUNEL等凋亡检测、免疫荧光等也从未脱过片。
细胞爬片的操作
1.胰酶消化细胞后计数重悬细胞于完全培养基中。
2.加细胞前,根据玻片的大小,先在每个孔里准备放爬片的位置滴少量培养基,使玻片与培养皿靠培养基的张力粘合到一起,然后放玻片,防止加细胞悬液时玻片漂起,造成双层细胞贴片。(整个过程注意无菌操作)
3.根据自己的需要选择合适的细胞密度接入培养板内即可。
4.待细胞贴壁后,可去上清加含药培养基。
5.按照实验设计,作用一定时间后取玻片。取玻片时由于玻片与培养皿底结合较紧,张力较大,一般将注射器针头针尖向背面弄个小钩,这样将爬片轻轻勾起,用小镊子取出就可以了。如果要做诸如24h,48h,72h等这样时间点的实验的话,将所需数量的爬片取出时应用酒精灯火焰烧一下针头和镊子。末取出的可接着继续培养。
细胞爬片的固定
另外在保存细胞爬片的时候,一般用培养皿或板,先在皿底放一层面巾纸,然后再放爬片,这样方便做实验时取片。
细胞爬片取出后,一般用PBS洗2遍,然后再做固定。当然,有例外,比如做凋亡的TUNEL染色时就避免洗,因为凋亡的细胞在洗的过程中有可能会脱落。
然后盖上盖子,并在盖子上做标记,为避免混淆,可用透明胶带将盖子和皿连在一起。一般-20℃保存2-3个月的片子做免疫组化是没有问题的。
常用的固定液
1
冷丙酮
——可用于一般的免疫组化染色。
——将纯的丙酮预先放入冰箱-20℃后便为冷丙酮(放心,丙酮在此温度不会为固体的)细胞爬片取出后,PBS洗2遍,便可加入冷丙酮于-20℃(丙酮有很强的挥发性,注意将含有丙酮和爬片的器皿盖严,防止其挥发)
——固定10分钟,取出后,室温吹干,然后放入-20℃保存。
2
多聚甲醛(常用4%)
——可用于免疫电镜、免疫荧光以及TUNEL染色。
——主要检测组织内一些性能娇弱的抗原特别是细胞表面抗原,例如各类淋巴细胸分化决定簇(CD)、主要组织相容性抗原等
——室温固定15分钟后,将表面液体吹干,入-20℃保存
3
95%乙醇
——可用于免疫组化。
——优点:穿透性强、抗原性保存较好。缺点:但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差,使蛋白变性的作用轻,固定后可再溶解;染色过程中,温育时间长,抗原可流失而减弱反应强度。
——室温固定15分钟后,将表面液体吹干,入-20℃保存
4
甲醛(福尔马林)
——应用广泛。
——优点:形态结构保存好,且穿透性强,缺点: 甲醛放置过久可氧化为甲酸,使溶液pH降低,影响染色; 分子间交联形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇,使之不能充分暴露。可造成假阴性的染色结果
——室温固定15分钟后,将表面液体吹干,入-20℃保存。
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